A 재조합 세포 주를 이용한 심장 이온 채널 약물평가 권장 전압 프로토콜(2019.09.18.)

  1. 배경

비임상 이온채널 데이터는 의약품 개발 프로그램, 표준화 프로토콜, 데이터 품질평가 방법, 약물 효과 정량화를 위한 데이터 분석 계획 등의 규제 결정에 중요한 역할을 할 것으로 예상한다. 다음은 Comprehensive in vitro Proarhythmia Assay(CiPA)을 기반으로 한 Torsade de pointes (TdP)위험 평가를 뒷받침 하는 제안으로 패치 클램프 방법을 사용하며 hERG, CaV1.2, Late NaV1.5 및 Peak Nav1.5 채널 연구에 대한 권장 전압 프로토콜을 포함하고 있다. 권고안은 현재의 지식에 기초하고 있으며, 시간이 지남에 따라 앞으로 발전할 것으로 예상된다. 따라서 이 문서는 버전 관리를 위해 문서에 타임 스탬프 공고일자가 표시되어 있으며, 연구를 시작하기에 앞서 FDA에서 보유하고 있는 문서가 최신 상태인지, 특정 약물에 대해 테스트할 프로토콜이 명확한지 확인하는 것이 필요하다. 심장 이온 전류에 대한 약물 효과는 심장 안전성 문제를 해결하기 위해 사례별로 검토 부서에 추가 요청할 수 있다. hERG 프로토콜을 제외한 다른 이온 전류 연구 프로토콜은 정기적으로 검토되지 않는다.

  1. IC50 평가를 위한 이온 채널 프로토콜

각 이온 채널에 관한 약물 억제는 전압 프로토콜, 온도 및 추가적인 실험 요소에 민감하다. 따라서 데이터 분석 및 데이터 품질평가를 위해 각 이온 전류에 대해 표준화된 프로토콜을 사용하는 것이 필요하다. 여기서 데이터 품질이란 각각의 실험 시 측정되는 세포의 상태, 기록 품질 및 이온 전류의 안정성으로 정의된다. 전체 세포 조건에서 측정된 대부분의 이온 전류는 전체 세포 형성에 따른 시간 및/또는 활성 의존적인 특성에 따라 변하기 때문에, 약물 효과를 정확하게 평가하기 위해 약물 적용 전에 기본 외부용액(external solution)을 관류하여 전류의 안정성을 먼저 기록해야 한다. 기록에 사용하는 온도가 따로 명시되지 않는 한, 생리적 온도(∼37℃) 혹은 생리적 온도와 가까운 온도에서 수행되어야 한다.

  1. HERG 전류 프로토콜
- 배양액의 조성 : hERG

○ 외부용액(External solution(mM))  130 NaCl, 10 HEPES, 5KCl, 1MgCl26H2O, 1CaCl26H2O, 12.5 dextrose  pH adjusted to 7.4 with 5 M NaOH  ∼280 mOsM ○ 내부용액(Internal solution(mM))  120 K-gluconate, 20 KCl, 10 HEPES, 5 EGTA, 1.5 MgATP  pH adjusted to 7.3 with 1M KOH  ∼280 mOsM

이 용액을 사용하면 약 15mV의 액체 접합 전위가 발생하며, 명령 전압 단계에서 이를 고려해야 한다. 예를들어 명령 전압을 –80mV로 설정하려면 액체 접합 전위(-15mV)를 생각하여 –65mV를 사용해야 한다. 이때 직렬 저항 보정이 필요하다.

  • 실험방법

이 프로토콜에서 도출된 데이터는 hERG 전류에 영향을 미치는 약물 효능과 약물 노출 정도의 관계성을 이해하기 위해 사용된다. 밀착 저항값은 1GΩ 이상이어야한다. 이 전압 프로토콜은 약 5초간 지속되며 5초마다 반복된다. 전압 “램프 다운” 단계는 +40mV∼-80mV (1.2V/s의 전압 변화)에서 100ms의 지속시간을 갖는다. -80에서 –90mV까지의 작은 과분극 전압 펄스는 옴의 법칙에 따라 입력 저항을 계산하기 위해 사용된다. 기록된 세포의 품질과 지속적인 실험의 신뢰성은 안정된 유지 전류(탈분극 전압 단계 직전의 –80mV 단계와 관련됨) 및 입력 저항이 반영되어야 한다. 높은 밀착 저항값을 얻은 경우, 유지 전류 및 입력 저항이 세포 상태의 지표로 사용될 수 있으며, 초기의 전세포 투석기간(whole-cell dialysis period) 이후에는 실험하는 동안 안정성이 유지될 것으로 예상된다. 데이터는 2kHz에서 필터링 한 후 5kHz에서 디지털화해야한다. 가능한 경우, 양성 대조군으로 hERG 채널에 기인하지 않은 잔류 전류의 %를 확인하기 위해 실험이 끝날 때 1μM E-4031을 세포에 적용하여 확인한다.

그림 1. hERG 현재 프로토콜

약물을 적용하기에 앞서 안정적인 기준선이 측정되는지 확인하기 위해, 세포는 전압 펄스 프로토콜을 기반으로 기본 외부용액을 관류하여 연속적인 25회의 전류 측정이 약 10%의 오차 범위 내에서 유지하는지 확인한 후 약물을 적용한다. 약물 효과는 안정적인 hERG 전류 상태를 얻을 때까지 모니터링 되어야 하며, 각 세포는 안정적인 상태(80mV에서 전류를 유지하며 입력 저항으로 정의됨)에서 최대 두 개의 약물까지 노출할 수 있다. 가능한 경우 각 약물에 대해 최소 4개의 농도를 테스트할 것을 권장하며, 50% 전류 억제(IC50)와 관련된 농도를 더 잘 추정할 수 있도록 % 전류 억제를 ∼20%에서 80%까지의 억제 범위에서 수행하는 것이 필요하다.

hERG 전류는 램프 하강 단계 동안 외부 전류의 피크에서 측정된다. hERG 채널에 대한 약물 효능을 정량화하기 위해 이 프로토콜을 사용하며 안정화 상태의 hERG 전류 진폭 값(연속된 5개 전류 트레이스의 평균값)을 약물 적용 직전의 기본 external solution을 관류하여 측정된 마지막 5개의 트레이스로부터의 평균 진폭 값을 테스트한 약물 농도에 대해 표시하고, IC50과 Hill 계수를 생성하기 위해 Hill 방정식(무엇인지?)에 데이터를 표시한다. 또한 실험 데이터의 변동성을 추정하고, 계산된 억제 효력 매개변수의 불확실성을 정량화하기 위해 각 세포의 부분 억제 값이 있는 표를 제공해야 한다.

  1. CaV1.2 전류 프로토콜
 - 배양액의 조성 : Cav 1.2

○ External solution(mM)  130 NaCl, 10 HEPES, 4 KCl, 1MgCl26H2O, 1.8 CaCl2H2O, 10 dextrose  pH adjusted to 7.4 with 5 M NaOH

○ Internal solution(mM)  120 Aspartic Acid, 120 CsOH, 10 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 5 MgATP, 0.4 TrisGTP  pH adjusted to 7.2 with 5 CsOH  ∼290 mOsM

 - 실험 방법

CaV1.2 current 실험에는 적절한 전압 제어와 직렬 저항 보상이 필요하며, 밀착 저항값은 1GΩ 이상이어야 한다. hERG 전류 기록과 마찬가지로 –80에서 –90mV의 작은 과분극 단계는 기록된 모든 전류 트레이스는(가) 입력 저항 계산을 가능하게 한다. 높은 밀착 저항값을 얻은 경우, 고정 전류와 입력 저항을 세포 상태의 지표로 사용할 수 있으며, 실험 전반에 걸쳐 안정적으로 유지되어야 한다. CaV1.2 프로토콜의 전류 진폭은 5초마다 반복되며, 기본 external solution을 관류하여 최소 30개의 트레이스 동안 안정성에 도달해야 한다. 그다음 프로토콜이 계속되는 동안 배스(?)를 통해 약물을 노출한다. 세포의 상태가 안정적이면 최대 두 개의 약물까지 노출할 수 있다.

그림 2. CaV1.2 pulse protocol

CaV1.2 전류 진폭(누출 전류 감산 및 원시 값이 아님)은 0mV 단계에서 내부 전류의 피크와 “램프 다운” 단계에서 발생하는 내부 전류의 피크 (100ms에서 +30∼-80mV 까지의 램프 다운)의 두 곳에서 측정할 수 있다. 가능하면 실험 종료 시 측정된 전류가 CaV1.2 채널에 의해 매개된다는 것을 보여주기 위해 100μM verapamil을 적용해야 한다. 관류용액 속도는 기존에 보고된 유량에 맞추어 설정하며 반드시 기재되어야 한다. 액체 접합 전위는 최대 17mV로 예상되며 이를 고려해야 한다. 예를 들어 세포를 –80mV로 유지하려면 액체 접한 전위(17mV)을 고려하여 명령 전압을 –63mV로 사용해야 한다. 연속 저항 보상이 필요하며, 실험 시작 시 % 보상이 기록되고, 실험 전체에 걸쳐 변화가 발생할 때 재조정된다(%보상이 보고되어야 함). 데이터는 3kHz에서 필터링 한 후 10kHz에서 디지털화해야 한다.

  1. Late Nav1.5 전류
 - 배양액의 조성 : Peak NaV1.5

○ External solution(mM)  137 NaCl, 10 HEPES, 4CsCl, 1MgCl26H2O, 2 CaCl2H2O, 10 dextrose  pH adjusted to 7.4 with 5 M NaOH  ∼281-287 mOsM

○ Internal solution(mM)  130 CsCl, 7 NaCl, 1MgCl2*6H2O, 5 HEPES, 5 EGTA, 5 MgATP, 0.4 TrisGTP  pH adjusted to 7.2 with 5M CsOH  ∼290 mOsM

 - 실험 방법

Late NaV1.5 current 실험 시 밀착 저항 값은 1GΩ 이상이어야 한다. Late NaV1.5 전류는 아래의 전압 프로토콜을 사용하여 연구해야 한다. Late NaV1.5 전류를 유도하기 위해서는 150nM ATXII를 사용해야 한다. 이 프로토콜의 Late NaV1.5 전류 진폭은 10초마다 반복되며, 기본 external solution을 관류하여 최소 12회 연속 트레이스 동안 안정성을 유지해야 한다. 그런 다음 프로토콜이 계속됨에 따라 시험 약물이 적용될 수 있다. 가능하면 실험 종료 시 측정된 전류가 Late NaV1.5 채널에 의해 매개된다는 것을 보여주기 위해 30μM TTX(?)를 적용해야 한다. Late Nav1.5 전류(원시값이 아닌 저감된 오프라인)는 –15mV 단계의 끝에서 내부 전류와 “램프다운” 단계의 피크 전류 두 곳에서 측정할 수 있다. 약물 시험 후 TTX를 세포에 적용할 수 없는 경우, Late NaV1.5 채널에 의해 매개되는 % 내부 전류를 입증하기 위해 양성 대조군으로서 독립적으로 세포에서 시험해야 한다.

그림 3. NaV1.5 pulse protocol

연속 저항 보상이 필요하며, 실험 시작 시 % 보상이 기록되고 실험 전체에 걸쳐 변화가 발생할 때 재조정된다(% 보상이 보고되어야 함). 데이터는 3kHz에서 필터링한 후 10kHz에서 디지털화해야 한다.

  1. Peak Nav1.5 전류
 - 배양액의 조성 : Peak NaV1.5

○ External solution(mM)  137 NaCl, 10 HEPES, 4CsCl, 1MgCl26H2O, 2 CaCl2H2O, 10 dextrose  pH adjusted to 7.4 with 5 M NaOH  ∼281-287 mOsM

○ Internal solution(mM)  130 CsCl, 7 NaCl, 1MgCl2*6H2O, 5 HEPES, 5 EGTA, 5 MgATP, 0.4 TrisGTP  pH adjusted to 7.2 with 5M CsOH  ∼290 mOsM

 - 실험 방법

Peak LaV1.5 current 시험에는 적절한 전압 제어와 직렬 저항 보상이 필요하다. Peak NaV1.5 전류는 Late NaV1.5 전류와 같은 전압 프로토콜 및 external/internal solution을 사용하여 연구된다. Peak NaV1.5 전류 데이터에서 ATXII의 존재는 데이터 해석을 복잡하게 하므로 Late NaV1.5과 같은 세포/기록에서 파생되지 않아야 한다. 따라서 ATXII는 Peak NaV1.5 전류 실험에서 사용되지 않는다. Peak NaV1.5 전류 측정은 기본 external solution을 관류하여 전류가 안정해질 때까지 기록해야 한다. 그다음 프로토콜이 계속됨에 따라 시험 약물을 적용해야 한다. 가능하면 실험 종료 시 측정된 전류가 Peak NaV1.5 채널에 의해 매개된다는 것을 보여주기 위해 30μM TTX를 적용해야 한다. 약물 시험 후 TTX를 세포에 적용할 수 없는 경우, 양성 대조군으로서 독립적으로 세포에서 시험해야 한다. Peak NaV1.5 전류는 –15mV 단계에서 내부 전류의 피크에서 측정된다. 약물 효과를 정량화하기 위해 내향 전류 진폭의 절댓값이 사용된다. 이 실험에서는 데이터를 5kHz로 필터링 한 다음 20kHz로 디지털화해야 한다.

  1. 추천 약물

검사 민감도와 정확성 확립을 위해 각 전류에 대한 기준 약물을 포함해야 한다. 관심 이온채널에 대한 약물 효력의 추정이 가능하도록 다양한 농도를 시험해야 한다. 약물 농도는 가능하면 20%에서 80%까지 억제해야 한다. hERG 전류의 경우 cisapride, terfenadine, dofetilide를 권장한다. CaV1.2 전류의 경우 verapamil을 권장한다. Peak NaV 1.5 전류의 경우 flecainide을 권장한다. Late NaV1.5 전류의 경우는 ranolazine을 권장한다. 각 농도에 대해 데이터 재현성 평가를 돕기 위해 동일한 방법으로 4∼7개의 세포를 이용하여 실험할 것을 권장한다. 4. 참고문헌

  1. Recommended voltage protocols to study drug-cardiac ion channel interactions using recombinant cell lines, FDA, US.

  2. Sheng J, Tran PN, Li Z, Dutta S, Chang K, Colatsky T and Wu WW. Characterization of loperamide-mediated block of hERG channels at physiological temperature and its proarrhythmia propensity. Journal of pharmacological and toxicological methods. 2017. doi:10.1016/j.vascn.2017.08.006.

  3. Wu M, Tran PN, Sheng J, Randolph AL, and Wu WW. Drug potency on inhibiting late Na+ current is sensitive to gating modifier and current region where drug effects were measured. Journal of pharmacological and toxicological methods. 2019. doi:10.1016/j.vascn.2019.106605.

본 정보집은 연구개발과제 「시스템 약리학 기술을 이용한 통합 생체 심혈관 안전성 예측 모델 구축 연구(18182임상평406)」를 통해 마련되었습니다.

의약품 심장독성 스크리닝 기술 동향 정보집

발 행 일 2020년 3월 발 행 인 식품의약품안전평가원장 이동희 편집위원장 독성평가연구부장 정자영 편집 위원 임상연구과 이윤숙, 오우용, 김기순, 이종구, 이정연 집 필 임동석, 한성필, 김기석 문 의 처 (우)28159 충북 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명2로 187
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