Chapter 5 국내 적용 연구사례

5.1 이온채널 실험을 통한 심근세포 활동전위 변화의 예측

CiPA initiative의 이온채널 활동그룹에서 발표한 다중이온채널(multiple ion channel effects, MICE) 모델에서 제안되었던 기존의 7가지 이온채널들 중 가장 큰 영향을 미치는 IKr (hERG), ICaL (Cav1.2), INa/INaL (Nav1.5 fast/late)를 선택하였다. Fast와 late Nav1.5, Cav1.2, hERG 채널의 활성을 기록하기 위해 patch clamp 시험법을 이용하여, 각 이온채널이 활성화 될 수 있는 전압 프로토콜(voltage protocol)을 주입한 후, 전압 자극에 의해 유도된 전류를 측정한다. Late Nav1.5 전류의 경우, 50μM의 veratridine을 처리하여 Nav1.5의 내향성 fast peak 전류 후 느려지며 활성화 되는 전류를 분석한다. 각 이온채널에 특이적인 억제제를 처리하여 전류가 억제되는 현상을 통해 각 전류의 민감성과 특이성을 확인한다.

이온 채널 실험을 통한 심근세포 활동전위 변화의 예측은 「부록. 재조합 세포 주를 이용한 심장 이온 채널 약물 평가 권장 전압 프로토콜」의 지침을 참조하였다.

hERG 채널에 대한 약물결합 파라미터를 분석하기 위해 디자인된 특정 전압 프로토콜 (modified Milnes’ protocol)을 활용하여 0mV, 10초 동안 주입된 전압에 반응하여 형성된 전류값들을 대조군(control) 대비 분율(fraction) 값으로 분석된 값이 필요하다.

5.2 CiPA in silico 모델 해석

ORd(O’Hara-Rudy dynamic)모델은 건강한 사람의 심실 심근세포의 세포단위의 전기 생물학적인 작용기전을 설명하기 위해 개발된 모델로 심실 심근세포에 발현된 각 주요 이온채널 별 (INa, INa,late, Ito, ICaL. IKr, IKs, IK1, INaCa, INaK)전위의 합으로 구성되는 활동전위(action potential)를 시뮬레이션 하여, 특정 약에 의해 각 채널이 억제되었을 때 심실의 활동 전위를 예측한다3.

CiPA 프로젝트에서 사용하는 IKr-dynamic ORd 모델은 기존의 ORd 모델에 Markov 모델로 설명되는 hERG채널(IKr)과 약물의 상호작용에 의해 약물이 격리(trapping)되는 현상을 반영한 모델이다4. 이러한 수학적 모델로 예측된 활동전위를 통해 TdP 발생 위험을 정량적으로 평가하는 통상적인 척도로는 활동전위의 길이로 평가하는 활동전위 기간의 90%값인 APD90(Action Potential Duration measured to 90% repolarization) 등이 있지만 이는 TdP 발생 위험을 정확히 예측해주지 못하는 실정이다.

이러한 기존의 활동전위 기반 척도의 낮은 예측성을 보완하여 최근 새롭게 제안된 개념으로 qNET으로 대변되는 Torsade Metric Score(TMS)가 있다. qNET은 활동전위 동안 발생하여 유출되는 K+전위와 유입되는 Ca2+과 지연성 Na+전위의 합으로 계산되는 net current의 곡선 하 면적을 계산하는 척도이고, 이로부터 계산되는 TMS는 각 약물의 예상되는 TdP 발생 위험 등급(낮은, 중간 및 높은 위험) 별로 잘 분류되는 것이 확인되었다5.

In silico 방법의 적용을 위한 코드(hERG fitting, AP simulation, qNET 계산)는 CiPA 자원 홈페이지 (https://github.com/FDA/CiPA) 로부터 얻을 수 있다6. 그러나 이러한 코드의 실행을 위해서 ① 코드의 내제된 오류를 찾아서 수정해야 하고, ② 고성능 컴퓨터 성능이 요구되므로 최적의 실행환경을 찾아야 한다. CiPA resources의 CiPA-test 폴더의 코드를 실행하여 hERG 적합, Hill 상수 적합, 활동전위 시뮬레이션을 통해 qNet을 구할 수 있다. FDA가 공개한 방법처럼 R과 Rtools를 설치한 일반 데스크탑의 Microsoft 윈도우 환경에서 한 약물에 대해 부트스트랩 과정, hERG 적합, 활동 전위 시뮬레이션 과정을 2,000회 수행할 경우 수십 일이 소요된다. 시간을 단축하고 싶다면 병렬컴퓨팅 기법을 설정해야 한다. FDA가 공개한 코드의 오류 수정본과 최적의 실행 환경에 대한 정보는 가톨릭대학교 연구진을 비롯하여 국내에서 소수의 연구자들이 확보하고 있는 상황이다.

아울러 연구진이 수행한 Bnet(채널의 %block의 차)과 TMS(qNET의 평균값) 비교 연구에서 간단한 계산의 Bnet5xCmax 는 빠르고 간편한 심장독성 스크리닝의 참고로 쓰일 수 있어 효율성 증대와 비용 절감 효과를 기대할 수 있을 것으로 기대된다.7

5.3 줄기세포 유래 심근세포를 이용한 전기생리 실험과 해석

인체 줄기세포 심근 세포주(human induced Pluripotent Stem Cell derived-Cardiomyocyte, hiPSC-CM)에서 표준적인 실험 방법을 통해 의약품 평가 수행을 위한 다양한 파라미터를 측정한다. 표준적인 실험 방법은 「부록. 재조합 세포 주를 이용한 심장 이온 채널 약물 평가 권장 전압 프로토콜」의 지침을 따른다.

이 때 측정할 수 있는 파라미터는 MDP(Maximal Diastolic Potential), APA(Action Potential Amplitude), Vmax, APD50, APD90가 대표적이다. 줄기세포 유래 심근세포를 이용한 전기 생리 실험과 해석은 안전성평가연구소 연구진이 보유하고 있다.

5.4 임상 심전도 평가와 적절한 마커의 선정

CiPA에서는 기존 QT prolongation을 보완할 수 있는 새로운 바이오마커로서 Vicente 등이 제안한8 다양한 T파 관련 특성들을 반영하고자 하였다. QTc interval에 비해 JTpeak가 약물의 부정맥 유발 가능성을 더 잘 예측할 수 있다고 주장한다9. CiPA에서 임상 심전도 바이오마커로 JTpeak를 대표적으로 제시하였고, 이 연구결과는 한국인에서 행해진 임상시험에서도 재현되었으므로 임상시험에서 약물의 부정맥 유발 가능성을 평가할 때 사용하는 것이 적극 권장된다. 그러나 JTpeak를 측정하기 위한 심전도 기기는 현재 시판되어 있지 않으며 대부분의 심전도 기기 회사에서는 측정된 심전도의 원자료(raw data)를 제공하지 않아 JTpeak 분석이 어렵다.

따라서 JTpeak 분석을 위해서는 검증된 심전도 기기로부터 심전도 원자료(raw data)를 제조사의 협력을 얻어 추출하는 과정이 필요하다. 가톨릭대 연구진은 국내 심전도 기기 회사인 ㈜바이오넷의 “Cardio 7N” 제품을 사용한 국내 임상시험을 통해 JTpeak의 연장이 복합채널차단 약물에 의해서는 관찰되지 않고 hERG 채널을 주로 차단하는 약물에서 특이적으로 관찰되는 것을 검증하였다. 이는 해외의 임상시험에서 검증한 기존의 이론과 합치되는 결과이다.

심전도 원자료로부터 JTpeak를 분석하기 위해서는 다음과 같은 과정을 마쳐야 한다. 10초간 측정된 심전도 원자료는 500-1000Hz로 샘플링되어 노이즈 제거 필터가 적용되어야 한다. 리눅스(우분투) 환경에서 MIT에서 제공하는 WFDB (Waveform Database, https://www.physionet.org/)와 FDA에서 제공하는 ecglib (library for processing electrocardiogram, https://github.com/FDA/ecglib) 소프트웨어를 설치해야 한다.10 이후 심전도 원자료를 WFDB 포맷으로 변경하여 P, QRS, T 파형의 annotation 과정을 거치고 J 포인트와 T 파형의 피크 지점의 차를 JTpeak로 계산한다. T 파형이 다양한 변이를 갖고 있는 심전도 자료는 ecglib의 표준화된 알고리듬을 통해 일관된 분석 결과를 얻을 수 있다.

코드의 수정본과 최적의 실행 환경에 대한 정보는 가톨릭대학교 연구진이 보유하고 있고, 가톨릭대에서 자체 개발한 PIPET ECG 애플리케이션에서 (http://www.pipetapps.com/pipetecg) 간단한 심전도 원자료를 업로드하여 ECG annotation과 JTpeak의 계산을 할 수 있으나 많은 수의 심전도 자료는 자체 분석 환경을 갖추어 분석하는 것이 추천된다.